對生豬養(yǎng)殖業(yè)而言，非洲豬瘟是當(dāng)前最具危險性的傳染疾病之一自2018年冬季傳入我國以來以對我國生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失。非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種高度接觸性，致死率極高的烈性傳染病。由于非洲豬瘟臨床癥狀與豬瘟（CSF）和豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS）等病癥極其相似，所以僅通過臨床癥狀無法區(qū)分，因此需要使用分子生物學(xué)手段對非洲豬瘟病毒進(jìn)行檢測，以做到對非洲豬瘟病毒及時、快速、準(zhǔn)確的診斷，以確保將非洲豬瘟的威脅性降到最低。筆者將簡述目前常見的非洲豬瘟病毒檢測方法及注意事項，以期為生豬養(yǎng)殖從業(yè)人員在非洲豬瘟病毒檢測及非瘟防控提供參考。

1 非洲豬瘟病毒檢測方法

1.1 病原學(xué)檢測

ASFV的病原學(xué)檢測，主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、微滴數(shù)字PCR（Droplet Digital PCR, ddPCR）、線性指數(shù)PCR、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）、原位雜交技術(shù)（ISH）、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）、探針雜交技術(shù)等。

PCR檢測：PCR是疫病最早期采用的檢測方法，非洲豬瘟病毒的PCR檢測是根據(jù)其基因中的高度保守區(qū)序列，設(shè)計特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測和鑒定屬于所有已知病毒基因型的廣泛分離株。依據(jù)世界動物衛(wèi)生組織推薦的的PCR檢測方法，可以擴(kuò)增出22株不同的ASFV病毒，但傳統(tǒng)PCR方法由于耗時較長且對設(shè)備要求高，因此并未廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖一線。

巢式PCR：采用內(nèi)外兩對PCR引物，可以在檢測組織、血液樣品和培養(yǎng)物的基礎(chǔ)上，檢測昆蟲體內(nèi)所帶的ASFV。巢式PCR克服了單次擴(kuò)增平臺期效應(yīng)的限制，使擴(kuò)增倍數(shù)提高，從而極大的提高了PCR的敏感性；并且因為模板和引物的改變，降低了非特異性反應(yīng)連續(xù)放大進(jìn)行的可能性，保證了反應(yīng)的特異性；由于內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增的模板是外側(cè)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，第二階段反應(yīng)能否進(jìn)行，也是對第一階段反應(yīng)正確性的鑒定，因引此可以保證整個反應(yīng)的準(zhǔn)確性及可行性。

熒光定量PCR：熒光定量PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上對某些特定基因如p72、p54、K205R等設(shè)計引物和探針，使得檢測特異性和敏感性得到了較大的提升。非洲豬瘟傳入中國以來，由于部分豬場已經(jīng)出現(xiàn)CSFV、ASFV以及PRRSV混合感染的情況。因此，利用多重PCR技術(shù)不但可對混合感染的豬只做及時和準(zhǔn)確的診斷，而且還能極大程度減少檢測耗材的使用，縮短檢測時間。

微滴數(shù)字PCR檢測：ddPCR比普通熒光定量具有更高的敏感性和特異性，其采用終點稀釋方法實現(xiàn)了最小劑量單分子病毒的擴(kuò)增，進(jìn)而計算出樣品的起始濃度，最終達(dá)到對病毒含量的絕對定量。但由于微滴數(shù)字PCR需要使用較為昂貴的儀器設(shè)備和試劑，因此很難用于大規(guī)模樣品的檢測。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)：是一種“簡便、快速、精確、低價”的基因擴(kuò)增技術(shù)，可做到快速檢測非洲豬瘟病毒，通常30分鐘即可完成檢測。與常規(guī)PCR相比，環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，因此對儀器設(shè)備的要求較低，便于在養(yǎng)殖場、屠宰場、飼料廠進(jìn)行快速檢測，該檢測方法也是目前生產(chǎn)一線最常用的非洲豬瘟病毒檢測方法之一。

重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)：重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)是一種新興的分子學(xué)檢測方法，目前也被應(yīng)用于ASFV的檢測中，其原理類似于體內(nèi)的DNA的復(fù)制過程，通過生成重組酶-DNA復(fù)合物來啟動DNA的合成，進(jìn)而進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域的指數(shù)式擴(kuò)增。由于RPA的反應(yīng)溫度介于37-42℃之間，舍去了常規(guī)實時熒光定量技術(shù)中加熱到退火的過程，所以其反應(yīng)時間可以縮短至20分鐘左右。該方法在保證了擴(kuò)增敏感性和特異性的同時，又極大的縮短了檢測時間。

下圖為實時熒光定量技術(shù)檢測非洲豬瘟病毒的基本原理（圖1）。

圖 1實時熒光定量技術(shù)原理

1.2 血清學(xué)檢測

利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行的抗原檢測和抗體檢測，是血清學(xué)檢測的兩種重要手段。針對ASFV抗原的檢測方法主要有熒光抗體試驗、雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗、膠體金免疫層析法等；針對ASFV抗體的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、間接熒光試驗、膠體金免疫層析技術(shù)等。

血清學(xué)抗原檢測：目前世界動物衛(wèi)生組織推薦的用于抗原鑒定的方法為熒光抗體試驗，主要用于鑒定不產(chǎn)生紅細(xì)胞吸附試驗反應(yīng)的非洲豬瘟病毒毒株，通過熒光標(biāo)記單抗而檢測動物組織內(nèi)的抗原；在ELISA基礎(chǔ)上發(fā)展起來的雙抗夾心ELISA方法，運(yùn)用抗原抗體特異性結(jié)合原理，先將特異性抗體與固相載體結(jié)合，在此基礎(chǔ)上加入待檢抗原，然后加入酶標(biāo)抗體，使得一單位的抗原同時結(jié)合兩個單位的抗體從而形成所謂的“雙抗體夾心”，最后加入底物試劑與酶標(biāo)抗體結(jié)合，根據(jù)顯色深淺來判斷抗原含量。此外，ASFV的交叉引物擴(kuò)增結(jié)合免疫層析快速檢測方法，不僅方便快捷，且有著良好的敏感性。免疫膠體金技術(shù)是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，而膠體金免疫層析法則是運(yùn)用類似于側(cè)向流動免疫色譜分析的虹吸原理，來檢測樣品中抗原的有無，適合快速檢測和流行病學(xué)調(diào)查。

血清學(xué)抗體檢測：抗體檢測是血清學(xué)檢測中最常規(guī)的方法，目前針對p72、p30、p54、K205R等ASFV蛋白，國內(nèi)外都已建立了間接ELISA、競爭ELISA、阻斷ELISA等多種方法。目前市場上已有很多商品化ELISA試劑盒，特異性與靈敏度都非常高，是人們進(jìn)行ASFV檢測時的首選方法。同時，免疫膠體金技術(shù)針對包被分子的不同也可以用來檢測ASFV抗體，該兩種方法均是生產(chǎn)一線中快速診斷非洲豬瘟的方法之一。

2 非洲豬瘟病毒檢測注意事項

非洲豬瘟病毒檢測涉及樣本采集、樣本保存、樣本運(yùn)輸、樣本處理與最終檢測等多個環(huán)節(jié)，一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)紕漏，就極易出現(xiàn)假陽性或者假陰性的錯誤檢測結(jié)果。提高檢測可靠性，避免出現(xiàn)假陽性或者假陰性結(jié)果，我們需要做到以下幾點。

2.1 樣品端

規(guī)范樣本采集操作。隨機(jī)采樣時要注意仔細(xì)觀察豬的精神狀態(tài)，對精神狀態(tài)不好伴有發(fā)燒癥狀的豬只要重點采集確保不漏任何一頭；或者隨機(jī)采樣時，對全群豬只進(jìn)行間隔采集，保證不漏采任何一頭疑似豬只。當(dāng)采集的樣品為組織樣時，應(yīng)將樣品50%中性甘油溶液或含I00 μg/mL青霉素和鏈霉素的PBS溶液中，樣品采集完成后要置于低溫環(huán)境中保存和運(yùn)輸（12h內(nèi)可4℃環(huán)境中運(yùn)輸），到達(dá)實驗室至檢測前應(yīng)將樣品置于－20℃中保存，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2 試劑端

規(guī)范化檢測試劑的保存。很大一部分假陽性與假陰性的檢測結(jié)果，是由于檢測試劑保存不當(dāng)造成的。因此我們要規(guī)范化檢測試劑的管理，做好試劑的生產(chǎn)日期及失效日期登記，并將試劑保存在適宜的環(huán)境中。

2.3 病毒檢測端

病毒檢測過程中若存在不符合操作規(guī)程的地方也會導(dǎo)致檢測結(jié)果出錯。核酸檢測是微量操作，要求極為嚴(yán)格。首先，要做好檢測人員的專業(yè)知識和實操技能的培訓(xùn)，保證檢測人員在樣品處理端和加樣端的操作符合規(guī)程。另外樣品RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄的過程對操作人員的加樣速度、超純水以及潔凈度要求較高，如果環(huán)境中存在RNA酶則會使RNA降解從而導(dǎo)致檢測結(jié)果出錯。因此，在病毒檢測端在保證操作環(huán)境潔凈的同時一定要確保檢測人員有著較高的實驗室素養(yǎng)和實操水平。

3 總結(jié)

雖然分子生物學(xué)檢測非洲豬瘟病毒是診斷非洲豬瘟疾病最有效的、最便捷、最準(zhǔn)確的方法，但是要確保檢測結(jié)果的真實可靠就一定要將病毒檢測過程中每一個操作步驟都執(zhí)行到位，準(zhǔn)確可靠的結(jié)果能有效防止非洲豬瘟的進(jìn)一步擴(kuò)散，降低非洲豬瘟對生豬養(yǎng)殖業(yè)的威脅。